Sinh ra ở Vinh, lúc học hết tiểu học, chị được các thầy giáo trong đó có đồng chí Trần Phú giác ngộ, tham gia các phong trào yêu nước. Năm 1927, chị đã tham gia thành lập Tân Việt cách mạng Đảng, năm 1929 thoát ly và năm 1930 gia nhập Đảng Cộng sản Đông Dương. Sau đó, chị ra Bắc và được cử sang Hương Cảng, công tác tại văn phòng của đồng chí Nguyễn Ái Quốc. Chị được phân công làm liên lạc cho Cục Phương Nam thuộc Bộ Phương Đông của Quốc tế Cộng sản. Để đảm bảo cho công tác, chị đã cật lực học và trong một thời gian ngắn đã thông thạo 3 thứ tiếng Anh, Pháp, Hoa. Năm 1931, bọn phản động Quốc dân đảng bắt giam chị theo yêu cầu của thực dân Pháp ở Đông Dương. Chị đã giữ vững khí tiết, cùng với sự đấu tranh của Quốc tế đỏ, năm 1933 chị được trả tự do và bắt liên lạc với đồng chí Lê Hồng Phong. Năm 1934, đám cưới của chị cùng người đồng chí Lê Hồng Phong được tổ chức giản dị tại Thượng Hải. 

Năm 1935, chị được cử vào đoàn đại biểu đi dự Đại hội Quốc tế Cộng sản lần thứ VII tại Moskva. Lần đầu tiên trên diễn đàn một đại hội quốc tế, người phụ nữ Việt Nam 24 tuổi dõng dạc đọc bài tham luận về vai trò của phụ nữ Đông Dương trong cuộc đấu tranh chống chiến tranh đế quốc và bảo vệ hòa bình. Sau đại hội, chị tiếp tục học Trường Đại học Phương Đông. 

Đầu năm 1937, chị về đến Sài Gòn, được cử vào Xứ ủy Nam kỳ và được chỉ định làm Bí thư Thành ủy Sài Gòn - Chợ Lớn với bí danh Năm Bắc. Với sự sâu sát, nắm chắc tình hình, lực lượng, chị đã khéo léo chỉ đạo tổ chức các cuộc đấu tranh ngay trong lòng thành phố. Thời kỳ “Mặt trận Bình dân” là thời kỳ hoạt động sôi nổi với các cuộc đấu tranh của phong trào công nhân, phụ nữ, thanh niên... Trong thời gian này, đồng chí Lê Hồng Phong cũng hoạt động tại Sài Gòn. Năm 1939, con của hai người chào đời, đặt tên là Hồng Minh. Không bao lâu sau khi sinh con, chị phải gửi con lại cho cơ sở và gia đình ông bà Dương Bạch Mai chăm sóc. Do bị địch theo dõi gắt gao, đồng chí Lê Hồng Phong bị bắt, rồi chị Nguyễn Thị Minh Khai cũng bị bắt, bị đưa về bót Catinat và chúng bắt hai người nhận mặt nhau. Mặc dù bị tra tấn dã man, chị vẫn một mực trả lời không biết. 

Trong nhà tù, chị Nguyễn Thị Minh Khai đã lấy máu mình viết lên cánh cửa phòng giam lời thơ khí khái: 

Dù đánh, dù treo, càng cương quyết
Dù kềm, dù kẹp, chẳng sai lời
Hy sinh phấn đấu vì nhiệm vụ
Triệt để thực hành chết mới thôi. 

Sau khởi nghĩa Nam kỳ, bọn thực dân đã tử hình chị cùng với các nhà cách mạng Nguyễn Văn Cừ, Hà Huy Tập, Phan Đăng Lưu, Võ Văn Tần, Nguyễn Hữu Tiến tại Hóc Môn

Trước lúc hy sinh, chị đã gửi lời vĩnh biệt chồng, lời cảm ơn những người nuôi con mình và tước vải quần áo nhà tù đan gối gửi về tặng mẹ. Ngày 28-8-1941, trước khi ra pháp trường chị đã nhắn nhủ: 

Vững chí bền gan ai hỡi ai
Kiên tâm giữ dạ mới anh tài
Thời cuộc đẩy đưa người chiến sĩ
Con đường cách mạng vẫn chông gai.

Lời tâm huyết sau cùng của chị: “Việc chúng tôi làm là chính nghĩa. Vì muốn Tổ quốc chúng tôi được độc lập, dân chúng tôi được ấm no mà chúng tôi làm cách mạng”.

Đồng chí Nguyễn Thị Minh Khai - nhà lãnh đạo tiêu biểu của Đảng, của cách mạng Việt Nam, người Bí thư Thành ủy Sài Gòn - Chợ Lớn, hy sinh khi mới 31 tuổi nhưng cuộc đời, sự cống hiến cho sự nghiệp cách mạng là vô cùng to lớn, mãi là tấm gương, là biểu tượng đẹp của phụ nữ Việt Nam.